The TissueMieloma project – Artificial bone marrow to personalize the treatment of blood cancer patients – ended in December 2019 after four years of activity. TissueMieloma has been funded by the Generalitat Valenciana through the Prometeo 2016 program. The project is the result of collaboration between researchers from CBIT at UPV and the Hematology Service of the Hospital la Fe de Valencia.
El proyecto TissueMieloma – Médula osea artificial para personalizar el tratamiento de pacientes de cánceres de sangre – finalizó en diciembre de 2019 después de cuatro años de actividad. TissueMieloma ha estado financiado por la Generalitat Valenciana a través del programa Prometeo 2016. El proyecto es fruto de la colaboración entre investigadores del CBIT de la UPV y del Servicio de Hematología del Hospital la Fe de Valencia.
Resumen del proyecto
TissueMieloma ha desarrollado una plataforma de cultivo tridimensional basada en biomateriales funcionalizados para células de pacientes de Mieloma Múltiple. Hemos reproducido las interacciones entre células tumorales y matriz extracelular, en particular las relacionadas con la generación de resistencias a fármacos en situaciones clínicas. Estos modelos in vitro facilitarán el screening y desarrollo de nuevos fármacos que tengan como objetivo bloquear la interacción entre las células tumorales y su entorno, atacando el desarrollo de los mecanismos que las defienden de los fármacos existentes y generan cepas resistentes responsables de las recaídas que hacen que esta enfermedad sea hoy por hoy de muy difícil tratamiento.
Resultados y hechos destacados
En este proyecto hemos desarrollado la síntesis y fabricación de varios tipos de microgeles, geles para cultivo celular basados en micropartículas, funcionalizados con proteínas y secuencias peptídicas relevantes, y hemos optimizado su uso como medio de cultivo tridimensional de células de mieloma múltiple.
Como primera prueba de concepto de las plataformas materiales se ha confirmado la influencia de la interacción con fibronectina en el ciclo celular de las células plasmáticas o la generación de resistencia a la dexametasona por interacción con ácido hialurónico. Una vez se han validado los modelos en este sentido, hemos comprobado el papel de la interacción con colágeno tipo I y hemos desarrollado microgeles funcionalizados con distintas secuencias de péptidos y estudiado el efecto de su presencia en la respuesta de las células a fármacos antitumorales.
Hemos avanzado también en el co-cultivo de células madre mesenquimales de la médula ósea, cuya interacción con las células tumorales es muy importante en la progresión del tumor.
En concreto, en este proyecto se han desarrollado:
Microgeles de polímeros acrílicos que contienen nanopartículas magnéticas. Esto facilita su manipulación y hace posible la separación de células y microesferas después del cultivo, siendo posible su análisis por citometría de flujo. Estos microgeles están formados por micropartículas con forma esférica, de entre 5 y 20 micras de diámetro, producidas por emulsión.
Microgeles como soporte adherente para células mesenquimales de la médula ósea. En este caso, se trata de microesferas de mayor tamaño puesto que su objetivo es ofrecer superficies de adhesión para las células mesenquimales de médula ósea. Además, la superficie se funcionaliza mediante el injerto de fibronectina o ácido hialurónico.
Microgeles resistentes a los disolventes utilizados en la evaluación de cultivos celulares. Algunos protocolos de evaluación de los resultados del cultivo celular requieren la utilización de alcoholes que son capaces de disolver o al menos alterar significativamente la superficie de biomateriales como los empleados en este proyecto. Para poder disponer de estas técnicas se han desarrollado microgeles en los que las micropartículas son insolubles.
Microgeles funcionalizados con técnicas de Layer by Layer (LbL). Las técnicas de LbL depositan el recubrimiento de proteínas y polisacáridos mediante uniones electrostáticas. Hemos desarrollado protocolos para la funcionalización mediante colágeno tipo I, ácido hialurónico, heparina, heparán sulfato y otras biomoléculas.
Microesferas de alginato mediante microfluídica. Hemos puesto a punto la producción de partículas con diámetros comprendidos entre 20 y 400 micras, las cuales se mantienen inalteradas durante el cultivo celular. Estas microesferas posteriormente se han funcionalizado mediante LBL con colágeno tipo I y ácido hialurónico pudiéndose observar la implicación que tienen estas biomoléculas en cuanto a proliferación y resistencia a fármacos en una línea celular de mieloma. Mediante la utilización de quelantes del calcio se pudo disolver el microgel, permitiendo así el análisis de las células.
Microgeles funcionalizados con una variedad de biomoléculas. Se ha injertado proteínas o polisacáridos sobre la superficie de las microesferas utilizando los grupos carboxilo presentes en su superficie. Hemos injertado colágeno tipo I, gelatina, ácido hialurónico, heparina y heparán sulfato, y los protocolos empleados son extensibles a todas las biomoléculas de interés que se encuentran en la médula ósea.
Síntesis de secuencias de péptidos específicas de adhesión tumorales y su uso en microgeles. Este resultado se ha obtenido en colaboración con el grupo de la Dra. Mónica Dettin y la Dra. Annj Zamuner de la Universidad de Padua. Se han sintetizado tres secuencias peptídicas especialmente relevantes en la interacción entre las células tumorales y la fibronectina y se han injertado sobre la superficie de las micropartículas a través de un espaciador flexible. Estos microgeles abren una línea de gran interés porque permiten investigar el efecto de fármacos que puedan bloquear uniones específicas que generan resistencias en la célula tumoral.
Cultivo de células madre mesenquimales de médula ósea y líneas celulares de mieloma múltiple en microgeles. Comparación de la adhesión celular en microgeles funcionalizados con fibronectina o con ácido hialurónico. Efecto de la microtopografía y densidad de microesferas sobre la diferenciación espontánea a células del linaje óseo, una de las claves del desarrollo tumoral. Estudio del efecto de la funcionalización sobre el mantenimiento de la pluripotencialidad de MSCs de médula ósea, y sobre las líneas celulares de mieloma múltiple, sobre sus etapas proliferativas, y sobre su viabilidad.
Cultivos celulares a partir de muestras de pacientes humanos. A partir de células aisladas de los aspirados de médula ósea de donantes control y de muestras de pacientes con diagnóstico de mieloma múltiple, hemos optimizado protocolos de aislamiento, expansión, congelación y descongelación de células madre mesenquimales, y también de siembra en nuestros microgeles. Hemos puesto a punto paneles de marcadores celulares para citometría de flujo que permiten evaluar el avance de las diferentes poblaciones celulares de médula ósea y su viabilidad en la plataforma.
Diseño y construcción de un biorreactor adaptado al cultivo en microgeles. Con los microgeles desarrollados y pudiendo emplear placas de cultivo standard, con líneas celulares de mieloma múltiple y con aspirados de médula ósea de donantes no neoplásicos, estamos validando la capacidad predictiva de los cultivos en el biorreactor desarrollado.
Difusión de resultados
[1] Human mesenchymal stem cells growth and differentiation on piezoelectric poly(vinylidene fluoride) microsphere substrates. R. Sobreiro Almeida, M. N. Tamaño-Machiavello, E. O. Carvalho, L. Cordón, S. Doria, L. Senent, D. M. Correia, C. Ribeiro, S. Lanceros-Méndez, R. Sabater i Serra, J. L. Gomez Ribelles, A. Sempere. International Journal of Molecular Sciences 18, 2391 (2017) (índice de impacto 3.226, Q2 en las categorías “Biocheemistry and Molecular Biology” y en Chemistry, Multidisciplinary)
[2] Biomimetic microspheres for 3D mesenchymal stem cell culture and characterization. S. Clara-Trujillo, J. C. Marín-Payá, L. Cordón, A. Sempere, G. Gallego Ferrer, J. L. Gómez Ribelles. Colloids and Surfaces B: Biointerfaces 177, 68-76 (2019) (índice de impacto 3.973, Q1 en la categoría “Biophysics”)
[3] Biomimetic 3D culture environment as a model for the generation of drug resistance in multiple myeloma. Collagen and Hyaluronic Acid induce resistance to Dexamethasone. J. C. Marín-Payá,L. A. Martins, S. Clara Trujillo, L. Cordón, S. Lanceros-Méndez, G. Gallego Ferrer, A. Sempere, J. L. Gómez Ribelles. Blood (enviado)
[4] Biostable functionalized microgels to model the extracelular microenvironment in Multiple Myeloma. J. C. Marín-Payá,S. Clara Trujillo, L. Cordón, G. Gallego Ferrer, A. Sempere, José Luis Gómez Ribelles. En preparación
[5] Study of the role of specific peptide sequences from the extracellular bone marrow matrix on the drug resistance generation in Multiple Myeloma cells. S. Clara Trujillo, A. Zamuner, M. Dettin, G. Gallego Ferrer, José Luis Gómez Ribelles. En preparación
[6] Entornos biomiméticos para la estimulación de células en cultivos tridimensionales. S. Clara-Trujillo, C. M. Antolinos-Turpín, C. Ribeiro, S. Lanceros-Méndez, G. Gallego Ferrer, J. L. Gómez Ribelles. CASEIB 2016 XXXIV Congreso Anual de la Sociedad Española de Ingeniería Biomédica, Valencia 22 al 25 de Noviembre de 2016
[7] Smart injectable hydrogel with magnetic microspheres for the local mechanical stimulation of cells: in vitro proof of concept. S. Clara-Trujillo, C. Ribeiro, C. M. Antolinos-Turpín, S. Lanceros-Méndez, J. L. Gómez-Ribelles, G. Gallego-Ferrer. FEBS Workshop – Biological Surfaces and Interfaces: Interface Dynamics, Girona, julio de 2017
[8] 3D culture of multiple myeloma cells on protein functionalized microgel. J. C. Marín-Payá,S. Clara Trujillo, L. Cordón, R. Sabater i Serra, A. Sempere, L. Senent, G. Gallego Ferrer, J. L. Gómez Ribelles. ESAO 2018– European Society for Artificial Organs, Madrid, Septiembre de 2018. Resumen publicado en: International Journal of Artificial Organs 41(9):619-620 (2018).
[9] Human bone marrow mesenchymal stem cells expansion and multipotency is strongly influenced by the electroactivity of the culture substrate. M. N. Tamaño-Machiavello, E. Carvalho, L. Cordón, L. Senent, D. M. Correia, C. Ribeiro, S. Lanceros-Méndez, R. Sabater i Serra, J. L. Gómez Ribelles, A. Sempere. Poster 109. ESCCA, Thessaloniki (Greece), 24-27 September 2017.
[10] Biomimetic microspheres for 3D mesenchymal stem cells culture and characterization. S. Clara Trujillo, L. Cordón, A. Sempere, G. Gallego Ferrer, J. L. Gómez Ribelles. International Symposium on Bioinspired Macromolecular Systems (ISBMS) University of Aveiro, Portugal, 6th to 8th November, 2017
[11] Biomimetic functionalization of PLLA with acrylate brushes. M. Sprott, G. Gallego-Ferrer, M. Sanchis, M. Dalby, M. Cantini, M. Salmerón-Sánchez. ESAO 2018. European Society of Artificial Organs Congress, September 2018, Madrid, Spain. Resumen publicado en: International Journal of Artificial Organs 41(9):545-546 (2018).
[12] A novel 3D cell culture microsphere-based platform. S. Clara Trujillo, J. C. Marín-Payá, L. Cordón, A. Sempere, G. Gallego Ferrer, J. L. Gómez Ribelles. ESAO (European Society for Artificial Organs) Winter School, Baden, Austria, Enero 2019
[13] Functionalized microgels for cell culture in 3D environment. S. Clara-Trujillo, J. C. Marín-Payá, L. A. Martins, B. Díaz-Benito, L. Cordón, A. Sempere, I. Jarque, G. Gallego Ferrer, J. L. Gómez Ribelles. Ciber-BBN Annual Conference 2019, Tarragona, Spain, 21st to 22nd October 2019